Receta para preparar un PCR

En últimos tiempos hemos escuchado con más frecuencia el término “PCR”, sobre todo en pruebas médicas, pero ¿qué es, cómo se hace y cómo funciona? Eso no lo tenemos muy claro

Alina Gabriela Monroy-Gamboa y Sergio Ticul Álvarez-Castañeda/CIBNOR/DICYT La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) es una técnica empleada para replicar artificialmente en un laboratorio el ADN, siguiendo una metodología que basa en el proceso natural. Cuando el ADN se transcribe, lo realiza para cada una de las hebras de la doble cadena, en el laboratorio se ejecuta el mismo proceso. En el denominado “río arriba” que es un análogo a contra la corriente de un río la replicación comienza en un grupo hidroxilo. En el “río abajo” lo hace en un grupo fosfato, que son las marcas de referencia para iniciar o finalizar un nucleótido de los que conforman las hebras.

Para poder realizar la transcripción es necesaria la presencia de una enzima, la que se utiliza en el laboratorio para duplicar el ADN de manera artificial es la polimerasa, de allí proviene el nombre de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). La polimerasa ubicada en el extremo libre de ambas hebras y después del cebador donde procede a incorporar nucleótidos (moléculas que transmiten la información genética) para sintetizar nuevas cadenas de ADN.

De manera artificial en un laboratorio, replicar esta actividad resulta en la obtención de muchas copias de un segmento de ADN, a partir de solamente una molécula. En el laboratorio como en la cocina, hay que seguir instrucciones y recetas, así la receta para hacer un PCR sería:

Ingredientes:

ADN del organismo que se desea amplificar, es decir, aumentar el número de copias de un gen, incluso con solamente una cadena de ADN es suficiente.
La enzima de la polimerasa.
Iniciador o cebador para la hebra río arriba y para la de río abajo. El cebador debe contener entre 15 y 30 nucleótidos.
Desoxinucleótidos (monómeros que forman el ADN).
Cloruro de Magnesio, es el más común, se usa para que la polimerasa comience su actividad.
Fosfatos.
Solución amortiguadora para mantener un pH óptimo.
Y como en todas las recetas, siempre cada cocinero tiene sus “especias” secretas que hacen que el producto sea mejor.

Instrucciones:

Los ingredientes se mezclan en un tubo y se cocina, por lo general a tres temperaturas, varias veces, cada vez es un ciclo y en cada uno existe la duplicación de una hebra, lo común son 35 ciclos, lo que equivale a un resultado de 2 35 hebras por cada hebra o sea 34,359,738,368 copias teóricas. El procedimiento se deberá realizar en un termociclador que es un equipo que permite rápidas variaciones de temperatura, así como mantenerlas de manera exacta con variaciones de menos de 0.1 grados centígrados. La primera temperatura de cada ciclo es entre 94-96° C por unos 45 segundos, entonces se separan los puentes de hidrógeno que mantienen la estructura de doble hélice del ADN, a este proceso se le conoce como desnaturalización; una vez separadas las hebras de ADN puede tenerse un molde y se puede empezar su duplicación. Al terminar esta temperatura se debe de pasar a la siguiente lo más rápido posible, en cuestión de segundos. La segunda temperatura, que deberá ser de entre 40 y 60° C por 50 segundos, se le conoce como alineación, como su nombre lo indica, durante este proceso los iniciadores se alinean a sitios específicos a partir de los cuáles se requieren hacer las copias del segmento. Se incrementa la temperatura a 72° C por 60 a 90 segundos y entonces se produce la síntesis de una nueva cadena de ADN en ambos sentidos, este proceso se llama extensión del ADN. El ciclo de cambios de temperaturas deberá repetirse cuantas veces sea necesario para lograr billones de copias del segmento de ADN elegido.

Al concluir los ciclos de cambios de temperatura, se realiza la lectura del producto obtenido por medio de una electroforesis. La electroforesis es una técnica que ayuda a medir visualmente si la amplificación fue exitosa o no, y el tamaño del fragmento obtenido. Se usa un control negativo y un control positivo para tener puntos de referencia. Cuando el PCR se utiliza para un diagnóstico médico, como el caso de COVID-19, el iniciador o cebador es un fragmento único y exclusivo del virus a examinar, de esta manera si el virus no está presente no existe ningún resultado del PCR.

Explicado de esta manera la técnica parece sencilla, pero la conceptualización (Kjell Kleppe Nobel de Química de 1968) e implementación (Kary Mullis Nobel de Química de 1993) implicó la entrega de varios grandes premios, resalta la complejidad y notoriedad de la misma. La importancia del PCR es tal que The New York Times consideró "altamente original y significativo, virtualmente dividiendo la biología en dos épocas de antes de P.C.R. y después de P.C.R."

En los últimos años nos hemos familiarizado más con las siglas PCR, debido a que esta técnica ha sido la más usada para saber si una persona está contagiada o no de SARS-COVID-19. Esta enfermedad hizo visible la terminología y metodología de los laboratorios de investigación a la sociedad en general. El PCR no es específica para esta enfermedad, al poder usar ADN de cualquier organismo (virus, animal, planta, etc.) es de gran utilidad en diferentes aspectos de la medicina humana, biología, ecología, bioquímica y todos los aspectos relacionados a la vida dende el ADN nos pueda ar una respuesta.

El gran avance de la tecnología no ha ayudado a replicar algunos comportamientos de la naturaleza a modo de recetas de cocina. La interpretación de los resultados nos ayuda a comprender mejor nuestro entorno y actuar a favor de ello.

Autores

Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S. C. Instituto Politécnico Nacional 195, CP. 23205, La Paz, Baja California Sur, México. Email beu_ribetzin@hotmail.com (AGM-G), sticul@cibnor.mx (STA-C).